1. Was ist Gelelektrophorese?
2. Wie mache ich die DNA-Restriktions-Fragmente sichtbar?
3. Was sind alternative Färbemethoden?
4. Was sind die Unterschiede zwischen vertikaler und horizontaler Elektrophorese?
5. Welcher Elektrophoresepuffer werden für die Gelelektrophorese verwendet?
6. Simulation einer eindimensionalen Elektrophorese von Proteinen.

Gelelektrophorese trennt Gemische aus geladenen, hochmolekularen Stoffen in einem elektrischen Feld nach ihrer relativen Größe auf. Kleine Moleküle wandern schneller als große.
Polyacrylamid-Gele für DNA-Fragmente bis 1000BP = 1kilobase (kb)
Hier: Agarose-Gel: Trennung von DNA Fragmenten im Bereich von 150 - 20.000 BP
Agarose ist die Reinform eines linearen Polysaccharides aus alternierenden D-Galactose- und 3,6-Anhydro-L-Galactose-Einheiten, wird aus Agar isoliert, der wiederum aus Algen gewonnen wird.
An einem Ende der Gelschicht sind kleine, rechteckige Taschen. Diese werden durch Zähne eines Kamms geformt, der vor dem Gießen des Gels angebracht wird. Nach dem Erstarren des Gels wird Puffer in die Elektrophoresekammer eingefüllt und das Gel mit Puffer überschichtet. Der Puffer stellt den Kontakt zwischen den Elektroden auf beiden Seiten des Gels her. Die Ionen in der Lösung leiten den elektrischen Strom. Außerdem bewahrt die Lösung das Gel vor dem Austrocknen. Vor dem Auftrag werden die DNA-Proben mit einer farbigen Markerlösung gemischt. Der Marker bewirkt, daß sich die DNA auf dem Boden der Taschen sammelt und zeigt die Front der wandernden Stoffproben an: Er wandert schneller durch das Gel als alle DNA-Fragmente, die kleiner als 300 Basenpaare sind. Die Elektrophorese wird gestoppt, sobald der Marker durch das Gel gewandert ist.
Durch Anschließen an eine Gleichspannungsquelle wird ein elektrisches Feld aufgebaut. Phosphatgruppen geben der DNA eine negative Ladung, so daß sie vom Minus- zum Pluspol wandert (von der Kathode zur Anode).

Die DNA-Fragmente sind farblos, also im Gel unsichtbar. Das Gel wird in eine Färbelösung gebracht, um die DNA zu färben. Die Farbmoleküle heften sich an die DNA-Moleküle im Gel, so daß diese ebenfalls sichtbar werden. Um besseren Kontrast zu erreichen, wird nach dem Färben das Gel mit Wasser entfärbt, so daß die Banden hervortreten. Dann können die Schüler die Muster der geschnittenen DNA-Proben miteinander vergleichen.
Im Wissenschaftsbetrieb wird i.a. Ethidiumbromid verwendet, das mutagen ist.
Für Praktika verwendet man i.a. Methylenblau, das keine Sicherheitsprobleme aufwirft und über Hausabwässer entsorgt werden kann.

Damit DNA im Gel sichtbar wird, muß diese angefärbt werden. Normalerweise verwendet man dafür Ethidiumbromid, welches zwischen die Basenpaare der DNA interkaliert und bei Bestrahlung mit UV-Licht orangefarbig fluoresziert. Beim Schülerexperiment wurde für die Färbung der DNA am Ende der Elektrophorese bewußt auf die Verwendung von Ethidiumbromid verzichtet. Der Verzicht erklärt sich aus mehreren Gründen: Erstens ist Ethidiumbromid eine Substanz, die mutagen sowie stark giftig ist, zweitens muß Abfall, der diese Substanz enthält, als Sondermüll entsorgt werden und drittens wird für die Sichtbarmachung der so gefärbten DNA eine UV-Lampe benötigt, die nur in Ausnahmefällen in Schulen vorhanden sein dürfte. Die Dokumentation der mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-Banden kann prinzipiell nur fotografisch erfolgen. Der dadurch erforderliche Einsatz von Kamera, Entwicklung etc. ist von Schulen kaum zu leisten. Methylenblau stellt eine Alternative zu Ethidiumbromid dar (NEVERS o.J.). Die mit Methylenblau angefärbte DNA erscheint als blaue Bande im Gel und ist gut zu erkennen.
Die für Ethidiumbromid beschriebenen Nachteile treffen auf Methylenblau nicht zu. Zwar ist Methylenblau in der Gefahrstoffliste beim Verschlucken als gesundheitsschädlich ausgewiesen, allerdings erst ab einem Massenanteil in einer Verdünnung von 25%. Da die Schüler jedoch nur mit Verdünnungen von 1 bzw. 0,025% arbeiten, ist von keiner Gefährdung auszugehen. Entsorgt werden kann Methylenblau in den verwendeten Konzentrationen in ausreichender Verdünnung über den Ausguß. Beim Färbevorgang selbst sollte man mit Einweghandschuhen arbeiten, da die Haut den Farbstoff vorübergehend annimmt und dieser nur relativ schwer zu entfernen ist. Die Auswertung der Gele kann mit bloßem Auge erfolgen. Erleichtert wird die Auswertung allerdings unter Weißlichtdurchleuchtung, wie sie z.B. mit Hilfe eines Tageslichtprojektors geschehen kann. Als störend kann sich die höhere Nachweisgrenze für DNA erweisen. Bei Methylenblau gefärbten Gelen liegt die Nachweisgrenze für DNA in etwa bei 40 ng pro Bande und ist somit etwa viermal höher als bei einer Färbung mit Ethidiumbromid.
Dennoch überwiegen die Vorteile von Methylenblau im Vergleich zu Ethidiumbromid. Deshalb sollte man im Schülerexperiment immer auf Methylenblau zurückgreifen.

Eine Frage bezüglich Proteinelektrophorese: Ich verstehe nicht ganz, warum Proteinelektrophorese immer (ausnahme IEF) in vertikalen Kammern durchgeführt wird und dagegen Nukleinsr. Elektrophorese immer in horizontalen Kammern. Könnten Sie mir die Gründe nennen?

Zwischen vertikaler und horizontaler Gelelektrophorese besteht grundsätzlich kein Unterschied. Sowohl Proteine als auch Nukleinsäuren können sowohl vertikal wie auch horizontal aufgetrennt werden. Da Proteine in der Regel jedoch in Polyacrylamidmatrices aufgetrennt werden, die nur unter Luftabschluß auspolymerisieren, bietet es sich an, diese Gele zwischen zwei Glasplatten anzufertigen. Es gibt beliebig viele Anwender, die so auch ihre Nukleinsäuren auftrennen und von daher nur vertikale Elektrophoresen laufen lassen. Da die Auftrennung von Nukleinsäuren jedoch auch in Agarose erfolgen kann und die Agarose auch ohne Luftabschluß fest wird, ist es für viele Anwender einfach bequemer die Agarose einfach auf einem horizontalen Tray fest werden zu lassen. Dies erspart das Handling mit Glasplatten, bei dem mitunter die Gelmatrix auslaufen kann, wenn die Platten nicht sorgfältig zusammengesteckt wurden.

Entweder TBE-Puffer (89 mmol/l Tris pH 7,6; 89 mmol/l Borsäure; 2 mmol/l EDTA) oder TAE-Puffer. TAE - Puffer wird als Elektrophoresepuffer für Agarose-Gele verwendet. Ursprünglich wurde er jedoch für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit geringfügig anderer Zusammensetzung entwickelt (40 mM Tris; 20 mM NaOAc; 2 mM EDTA · Na2; pH 7,8 bei 5°C mit Essigsäure; Ref. 1). Heute verwendet man den Puffer in leicht modifizierter Form (40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA · Na2; ~pH 8,5). TAE hat eine niedrigere Pufferkapazität als TBE, allerdings wandert doppelsträngige, lineare DNA 10 % schneller bei gleicher Auflösung durch TAE als durch TBE. 'Supercoiled' DNA wird jedoch besser in TAE als in TBE aufgetrennt. Normalerweise verwendet man den Puffer in der Arbeitskonzentration 1X oder 0,5X. TAE wird bei Raumtemperatur gelagert.

Simulation einer eindimensionalen Elektrophorese von Proteinen, die sehr gut die Prinzipien der Elektrophorese veranschaulicht - Englisch